Informes de Investigación

URI permanente para esta comunidad

https://digital.cic.gba.gob.ar/handle/11746/183

Examinar

Examinando Informes de Investigación por Autor "Aphalo, Paula"

Mostrando 1 - 4 de 4
  • Informe de investigador
    Acceso Abierto
    Informe científico de investigador: Aphalo, Paula (2011)
    (2011) Aphalo, Paula
    Como se mencionara en el pasado informe, el objetivo del plan de trabajo propuesto fue generar conocimientos que sirvan de base para la preparación de ingredientes funcionales derivados de brotes de amaranto (Amaranthus hypochondriacus). A partir del objetivo planteado, y teniendo en cuenta las actividades propuestas en el plan de trabajo se detallarán a continuación los resultados obtenidos: - Preparación de ingredientes de distinta composición peptídica Se prepararon tres fracciones proteicas diferentes utilizadas como material de partida para la realización de las diferentes actividades propuestas. Las mismas fueron: un aislado proveniente de semillas germinadas durante 48 horas (HIG48), las proteínas contenidas en el suero denominado (SN HIG48) y las presentes en un extracto crudo de brotes (ECr.G48) mediante una extracción alcalina. Una vez obtenidas estas muestras, las mismas fueron sometidas a una posterior digestión gastrointestinal simulada in vitro (Roessler y Rao, 2001). - Caracterización y análisis la actividad fisiológica de las diferentes muestras antes y luego de ser sometidas a una digestión gastrointestinal simulada in vitro. Se efectuaron ensayos de caracterización estructural realizados sobre las muestras mencionadas anteriormente, tales como: cromatografía de exclusión molecular utilizando rellenos con diferente grado de separación y electroforesis utilizando diferentes sistemas de separación: SDS-PAGE y SDS-PAGE/ Tricina Los perfiles electroforéticos encontrados, permitieron inferir que las muestras presentaron una mayor proporción de péptidos de tamaño menor a los encontrados en los aislados sin germinar con un tamaño menor a los 30 kDa. Las muestras, sometidas a digestión evidenciaron tamaños aún menores a las muestras sin tratamiento enzimático con un tamaño promedio menor a los 12 kDa. En cuanto a los ensayos cromatográficos, se encontró que la muestra (SN HIG48) contiene varias poblaciones de moléculas proteicas con una masa molecular menor a los 12 kDa. Se continuará con la separación de las muestras mencionadas utilizando rellenos que permitan la separación de péptidos.Una vez identificadas la/s moléculas activas se las pasará por RP-HPLC de manera de lograr una mejor resolución y purificación de las fracciones activas. En cuanto a la medidas in vitro de la actividad antihipertensiva, el método utilizado es el empleado por Hürst y Lovell-Smith (1981). Los valores encontrados de IC50 para las muestras ensayadas fueron los siguientes: HIG48: 0,4 [mg/ml]; HIG48dig.: 0,2 [mg/ml]; SN HIG48: 0,89 [mg/ml]; SN HIG48dig: 0,2 [mg/ml] Los resultados obtenidos indican que las muestras tratadas con enzimas gastrointestinales poseen un mayor potencial inhibitorio de ACE que las proteínas de las cuales provienen. Este hecho implica que la digestión provocó la liberación de péptidos encriptados con potencial actividad antihipertensiva. de Proteínas y Coloides Industriales. (JIPCA VI) cuya referencia se indica en el inciso 13 del presente informe de actividades. Los resultados descriptos junto a ensayos tendientes a determinar la capacidad antioxidante de las muestras en estudio y la composición centesimal de brotes formarán parte de una futura publicación cuya discusión y escritura se concretará a la brevedad. Los estudios relacionados con las características estructurales de los diferentes componentes de la fracción globulina de amaranto cuyos resultados fueron detallados parcialmente en el informe anterior, fueron ampliados incluyendo la determinación de la posible capacidad antihipertensiva de las fracciones 7 y 11 S las cuales también fueron sometidas a digestión gastrointestinal. Los resultados obtenidos no mostraron diferencias significativas entre los componentes mayoritarios de la fracción globulina luego de ser sometidos a una digestión gastrointestinal simulada. Estos resultados, han sido publicados en el Journal of the Science of Food and Agriculture cuya referencia se detallará en el inciso 7 de este informe. Los resultados parciales de este trabajo, fueron asimismo presentados en el marco del XIII Congreso Argentino de Ciencia y Tecnología de los Alimentos (CYTAL 2011) indicados en el inciso 13 de este informe.
  • Informe de investigador
    Acceso Abierto
    Informe científico de investigador: Aphalo, Paula (2013)
    (2013) Aphalo, Paula
    Como punto de partida, se preparon aislados de amaranto por extracción acuosa en medio alcalino (pH 9) y posterior precipitación isoeléctrica (pH 5), según el procedimiento utilizado comúnmente en nuestro laboratorio (Martínez y Añón, 1996). Se determinó la solubilidad de los aislados, en dos buffers: a) con elevada fuerza iónica (K2HPO4 32,5 mM, KH2PO4 2,6 mM con NaCl 0,4M pH 7,5) y b) de baja fuerza iónica (K2HPO4 33,3 mM, KH2PO4 1,7 mM pH 8,5), en ambos la solubilidad fue cercana al 80%. Los aislados fueron posteriormente hidrolizados en diferente extensión haciendo uso de la enzima alcalasa (8 μl enzima/100 mg proteína) a 37º C durante 1, 2, 4, 6, 22 y 26 horas. La reacción enzimática se detuvo por calentamiento a 80ºC durante 10 minutos. Las muestras fueron congeladas, liofilizadas y almacenadas en desecador hasta su uso. El grado de hidrólisis de las muestras fue determinado mediante el ensayo de OPA (Nielsen y col 2001), obteniéndose los siguientes resultados: 1h 8,70 ± 0,78 %, 2h 8,82 ± 0,81 %, 4h 16,48 ± 1,76 %, 6h 19,84 ± 0,72 %, 22h 30,2 ± 3,01 % y 26h 35,2 ± 2,20 %.Los hidrolizados obtenidos fueron caracterizados mediante SDS- PAGE tricina; los perfiles electroforéticos obtenidos permitieron concluir que la hidrólisis de las moléculas de mayor tamaño presentes en el aislado entero son completamente hidrolizadas en el transcurso de la primera hora de reacción. Los polipéptidos de mayor resistencia a la hidrólisis fueron las subunidades básicas (20 kDa) las cuales fueron detectadas hasta las 6 horas de hidrólisis; a tiempos más largos, 21 y 26 horas, los mismos no pudieron ser detectados mediante el ensayo de electroforesis. Los hidrolizados también fueron analizados mediante Cromatografía de exclusión molecular (AKTA-purifier). Para ello, se utilizó una columna con un rango de separación de masas moleculares entre 100-7000 Da, y una longitud de onda para la detección de 214 nm. Los resultados obtenidos nos permitieron concluir que a partir de las 21 horas de hidrólisis se encuentran presentes en los hidrolizados mayoritariamente moléculas con una masa molecular no mayor a los 2000 Da; a tiempos menores se detectan especies con una masa molecular mayor a los 7000 Da que eluirían a volúmenes coincidentes con el volumen muerto de la columna. Continuando con las actividades planteadas, todos los hidrolizados obtenidos con alcalasa fueron sometidos a una digestión gastrointestinal simulada (item 2 plan de trabajo presentado). Brevemente, la digestión se inició con la adición de un fluido símil saliva (conteniendo diferentes sales y 290 mg/l α-amilasa a pH 6,8) a las muestras en estudio (aislado no tratado e hidrolizados con alcalasa), al cabo de 5 min se les adiciónó un símil fluido gástrico (conteniendo NaCl 0,03 M y 2,5 gr/l pepsina pH 2,0). Luego de 1 h se agregó un símil de fluido duodenal conteniendo bicarbonato de sodio 0,1 M y pancreatina, de manera de alcanzar un pH 7 - 7,5; manteniéndose la incubación por 1 h adicional. Las muestras se mantuvieron con agitación por inversión a 37 ºC durante todo el proceso. Una vez finalizada la simulación de la digestión gastrointestinal, se detuvo la reacción enzimática por calentamiento a 80 ºC durante 10 minutos. Las muestras digeridas obtenidas, fueron congeladas, liofilizadas y almacenadas en desecador hasta su uso. El grado de hidrólisis de las muestras hidrolizadas y digeridas fue determinado mediante el ensayo de OPA; los resultados obtenidos fueron los siguientes: aislado digerido: 25 %, 1 h: 25,4 %- 2 h: 27,3 %- 4 h: 27, %- 6 h: 29,6 %- y 22 h: 35,8 %. Estas muestras fueron analizadas mediante cromatografía de exclusión molecular: en todos los casos se observó un aumento significativo de las poblaciones peptídicas con un tamaño molecular que no superarían a los 6 aminoácidos. A efectos de determinar la potencial actividad antihipertensiva de los péptidos obtenidos y caracterizados y vistos los problemas de importanción existentes se se tuvo que extraer enzima conversora de angiotensina (ECA) a partir de pulmones de conejo. (item 3 del plan de actividades anteriormente presentado).Se realizaron extracciones con diferentes buffers (fosfato y borato de sodio) a idéntica concentración y pH 8,3. La medida de actividad enzimática de los extractos crudos obtenidos se realizó de acuerdo a la técnica descrita por Hurst y Lowell 1981. Los resultados obtenidos, evidenciaron que la ECA fue activa cuando se utiliza buffer borato como solvente de extracción. Se realizaron corridas electroforéticas en condiciones desnaturalizantes de los extractos crudos obtenidos a partir de los pulmones de conejo y de una ECA comercial (marca Sigma-Aldrich) y se compararon los perfiles obtenidos. Los mismos fueron coincidentes, observándose una banda de mayor intensidad con una masa molecular de 140 kDa, masa molecular de la ECA según datos registrados en bases de datos para proteínas secuenciadas. Se encuentran en curso los ensayos tendientes a determinar la actividad antihipertensiva potencial de los hidrolizados con alcalasa y aquellos posteriormente sometidos a la digestión gastrointestinal simulada.
  • Informe de investigador
    Acceso Abierto
    Informe científico de investigador: Aphalo, Paula (2014)
    (2014) Aphalo, Paula
    Introducción: El estudio de la prevención de la hipertensión ha sido sin lugar a dudas uno de los mayores desafíos científico-tecnológicos; con una importante incidencia en la salud pública y la economía. En relación a esto, los alimentos funcionales han surgido como una ayuda o alternativa a las terapias químicas destinadas al manejo de enfermedades crónicas de amplia distribución, como hipertensión, diabetes, hipercolesterolemia y obesidad. (Kris-Etherton y col., 2002). A partir de lo anterior y basándonos en los antecedentes bibliográficos publicados por nuestro grupo de trabajo y otros autores, nos hemos planteado los siguientes objetivos: Objetivo general: Medir la posible capacidad inhibitoria de hidrolizados de amaranto luego del tratamiento con altas presiones y péptidos sintéticos (VIKP y ALEP) sobre diferentes enzimas de regulación (ECA enzima convertidora de angiotensina, renina y ruta de las quimasas) del sistema renina-angiotensina (RAS) Objetivos específicos: 1 Obtención y caracterización de hidrolizados de amaranto con diferente grado de hidrólisis luego del tratamiento con altas presiones. 2 Caracterización de los ingredientes activos obtenidos en el ítem 1 y de péptidos sintéticos (VIKP y ALEP), luego de ser sometidos a una digestión gastrointestinal simulada.. 3. Medida de la resistencia de la capacidad inhibitoria de las muestras de estudio después de atravesar el sistema gastrointestinal simulado sobre diferentes enzimas del sistema renina angiotensina mencionadas anteriormente.
  • Informe de investigador
    Acceso Abierto
    Informe científico de investigador: Aphalo, Paula (2015)
    (2015) Aphalo, Paula
    En Argentina, 34% de los adultos y 60% de los mayores de 60 años son hipertensos. La prevención y estudio de enfermedades cardiovasculares, fundamentalmente la hipertensión, constituye un tema de interés para la salud pública nacional y provincial. He analizado, desde mi ingreso a CIC-PBA la posible capacidad inhibitoria sobre la enzima conversora de angiotensina (ACE) de brotes de amaranto y sus digeridos. Actualmente trabajo con aislados, hidrolizados y péptidos sintéticos (VIKP y ALEP) sobre la capacidad inhibitoria de ACE, renina y la ruta de las quimasas (vía alternativa que sintetiza un potente vasoconstrictor: angiotensina II). A corto plazo, se profundizarán los análisis de los mecanismos de acción de estos inhibidores y se realizarán estudios in vivo en un modelo de ratas espontáneamente hipertensas (SHR) junto con ensayos ex vivo de vasodilatación en músculo cardíaco y anillos de aorta. En paralelo me encuentro trabajando en colaboración con la Dra. Avanza en la caracterización estructural de cowpea (Vigna unguiculata) y con la Ing. Pinciroli en el estudio de la actividad biológica de arroz (Nutriar FCA yF) Programa Arroz.