Tesis de doctorado

Análisis de las alteraciones estructurales y/o regulatorias en los genes de nodulación y fijación de nitrógeno, en aislados de Bradyrhizobium japonicum que difieren en su capacidad de fijar nitrógeno

Resumen

La fijación biológica de nitrógeno (N) que consiste en la reducción de N2 atmosférico a NH3 realizada por algunos organismos procariotas, constituye el mayor aporte de nitrógeno a la biosfera. Entre estos organismos, los que fijan el nitrógeno asociándose simbióticamente con las plantas de la familia de las leguminosas son los que realizan el mayor aporte. Las interacciones bacteria-planta conducen a la formación de nódulos como parte de un proceso complejo, de numerosos intercambios de señales entre los simbiontes. La superficie cultivada con soja en la Argentina es de alrededor de 19 millones de hectáreas, esto y el valor de su producción lo convierten en el cultivo más importante del país. La soja es exótica en Argentina y América del Sur y por ello el 90 % de la superficie se inocula con bacterias del género Bradyrhizobium en el momento de la siembra. La incorporación de bacterias simbiontes de la soja durante muchos años hizo que las poblaciones de las mismas se naturalizaran en los suelos. Estas bacterias alóctonas pertenecen al género Bradyrhizobium e inducen la formación de nódulos en soja. En general estos rizobios alóctonos o naturalizados no son eficientes fijadores de nitrógeno en relación a las cepas seleccionadas para la formulación de inoculantes comerciales. La explicación es que si bien derivan de cepas eficientes, cuando se establecen en los suelos, sufren cambios genéticos que contribuyen a su sobrevivencia en el medio ambiente; si bien esto conduce a una mejora en su capacidad competitiva, habitualmente estas se ven alteradas negativamente en su capacidad de fijación de nitrógeno. En este sentido, uno de los problemas del uso de cepas fijadoras de N seleccionadas es que no suelen ser tan competitivas como las poblaciones naturalizadas en los suelos. El género Bradyrhizobium fue descrito en 1982 y dentro de este género la especie B. japonicum es el simbionte por excelencia de la soja. El genoma de B. japonicum contiene un alto número de secuencias repetitivas entre las que se han descripto RSα y RSβ. En B. japonicum y probablemente en el resto de las especies, estas secuencias se concentran en los fragmentos de ADN que contienen gran parte de los genes que codifican las enzimas de fijación de N (genes nif y fix). Estas secuencias repetitivas poseen características estructurales de los elementos de inserción de los procariotas y fueron asociadas con mecanismos de recombinación de los genomas. Esto y el hecho de que en la naturaleza es frecuente la aparición de mutantes espontáneos que difieren en su capacidad para fijar N, sugiere que los mutantes naturales probablemente se generan por rearreglos del genoma que ocurren particularmente en la isla simbiótica, en los que las regiones repetitivas podrían jugar un rol clave. Esto podría explicar los cambios en la capacidad de fijación que suele caracterizar a los mutantes naturales. El objetivo de este trabajo se focalizó en analizar las diferencias genéticas presentes en los fragmentos del genoma en donde se concentran gran parte de los genes de nodulación y fijación de N en 12 cepas de Bradyrhizobium. Estas fueron aisladas de suelos bajo diversos sistemas de manejo y se seleccionaron en base a su capacidad diferencial de fijación de N. Se propuso además realizar una caracterización fisiológica de los aislados y establecer en base a diversos marcadores moleculares, la relación que existe entre los rizobios aislados con los que se han utilizado en formulaciones comerciales de inoculantes. Además se analizó la expresión de genes clave de los procesos de nodulación y fijación de nitrógeno. Los estudios confirmaron que las cepas naturalizadas en los suelos difieren de los fenotipos de las cepas de origen que fueron B. japonicum y B. elkanii. La colección de los aislados estudiados provino exclusivamente de las cepas utilizadas en inoculantes comerciales (B. japonicum y B. elkanii) y si bien se encontró que son cepas estrechamente relacionadas, el análisis de las regiones repetitivas del genoma (Southern blot) demostró diversidad genética. Un grupo de estos aislados de B. japonicum que fijan nitrógeno con mayor eficiencia presentaron adaptaciones que podrían beneficiar su vida saprofítica; entre las que se destacaron una mayor supervivencia sobre semilla, mayor tolerancia al glifosato; mayor síntesis de exopolisacáridos e inducción de la formación de biopelículas por exudados de semillas de soja. El análisis más detallado de la isla simbiótica no mostró diferencias entre los aislados y la cepa E109 (comercial), excepto la secuencia del gen nopP que fue diferente en los aislados 2112 y 366. Al comparar los perfiles de expresión de genes de fijación de nitrógeno entre el aislado 366 y la cepa E109, se detectaron diferencias en la expresión de alguno de ellos, que no estuvieron asociadas a ningún fenotipo en particular. Estudios proteómicos de las proteínas secretadas en la interacción simbiótica bradyrizobio-soja que establecen E109 y 366, mostraron diferentes perfiles de expresión en las cepas, que además no respondieron a la presencia de exudados de semillas en el medio de cultivo. Las diferencias entre las dos cepas se centraron en la expresión de proteínas relacionadas con la motilidad bacteriana. Se concluyó que los fenotipos de fijación de N en los aislados no estuvieron vinculados a rearreglos ocasionados por regiones repetitivas en la isla simbiótica, si bien estos ocurrieron en otras regiones del genoma. La supervivencia, infectividad, producción de exopolisacáridos, formación de biofilm y agregados bacterianos y la motilidad, son características de las cepas alóctonas que probablemente contribuyen a su adaptación en el suelo. En las cepas naturalizadas son frecuentes los cambios vinculados a los mecanismos que modifican la motilidad de los mismos en el suelo. Es claro que la motilidad de los rizobios es un elemento clave que influye en las características competitivas de las bacterias. El estudio en profundidad de cada una de las características diferenciales entre los aislados que se naturalizan y la implicancia de estas en el resultados final del proceso de nodulación y fijación biológica de nitrógeno, pueden contribuir a una selección de cepas que mejoren la eficiencia de la relación simbiótica entre el inoculante y la planta de soja.

Palabras clave
Bradyrhizobium
Soja
Fijación del Nitrógeno
Expresión Génica
Isla simbótica
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