Informe de becario

Informe científico de Beca de Estudio: Pérez, Silvina (2013-2014)

Resumen

Con el objetivo de aislar e identificar microorganismos autóctonos de la anchoita salada y madurada, se realizaron los puntos 1 y 2: 1) Microorganismos y condiciones de cultivo. Para el crecimiento de microorganismos halófilos, se prepararon los medios de cultivo con 15 y 20 % de NaCl y se realizó la incubación a 37ºC durante 14-21 días. - Se aislaron microorganismos a partir de muestras de sal entrefina ya que la misma presentaba coloración rosada, indicadora de presencia de microoganismos halófilos. - Dado que se presentarón dificultades para el crecimiento de los microoganismos en medio Gibbons, generalmente utilzado para estas determinaciones, se realizó la comparación de diferentes medios de cultivo para el aislamiento a partir de muestras de sal (Medios: IRAM con leche y Abadejo con leche). Los mayores recuentos se dieron para el aislamiento en medio IRAM con leche. - Se realizó el aislamiento y recuento de microorganismos halófilos a partir de muestras de anchoíta tomadas en empresa elaboradora de la ciudad de Mar del Plata, durantre las primeras 48 hs del proceso de salado correspondiente a la elaboración de anchoíta salada y madurada. - Se seleccionaron microorganismos halófilos que habían sido previamente aislados en el subproyecto salado-madurado de anchoíta. 2) Identificación molecular. Si bien esta actividad no estaba prevista en el Plan presentado oportunamente, se vio la posibilidad de realizarlo y se consideró sumamente positivo para el resultado del Proyecto efectuar identificaciones moleculares. Por lo tanto, se está realizando la identificación molecular de los microorganismos aislados con amplicones 16S. Por el momento, se ha realizado la amplificación con primers para bacterias y se han identificado Lentibacillus/Virgibacillus (porcentaje de identidad: 94%), Chromohalobacter canadensis (porcentaje de identidad: 98%), Chromohalobacter spp. (porcentaje de identidad: 97%), Lentibacillus spp. (porcentaje de identidad: 93%) y Staphylococcus haemolyticus (porcentaje de identidad: 99%). Para las muestras que no se logró la amplificación con estos primers, se realizará la misma con primers para arqueas a fin de completar la identificación. Por otro lado, he realizado una estadía en el Laboratorio de Biología Molecular de la Universidad Estadual Paulista a fin de realizar entrenamiento en estas y ortras técnicas de identificación. En este Laboratorio se realizó la extracción de DNA metagenómico a partir de las muestras de sal con coloración rosada del mismo origen de la anterior. Para esto fue necesaria la puesta a punto de una técnica de extracción de DNA total de muestras consideradas de dificultoso procesamiento, como lo son las muestras de sal pura. La tarea específicamente consistió en: - Preparación de material descartable y de vidrio para esterilizar. - Preparación de reactivos. - Autoclavado de materiales y reactivos. - Pruebas de extracción de DNA total a partir de un kit marca Mobbio y de un procedimiento estándar para comparar resultados. - Puesta a punto de un procedimiento de extracción de DNA desarrollado durante la estadía. - Verificación de la extracción en cada etapa del procedimiento mediante electroforesis en gel de agarosa y cuantificación mediante el espectrofotómetro Nanodrop. - Amplificación de la fracción 16S del DNA por PCR con primers para arqueas y para bacterias. - Verificación de la amplificación mediante electroforesis en gel de agarosa y cuantificación con espectrofotómetro Nanodrop. - Verificación del tamaño del DNA amplificado mediante la secuenciación del mismo. - Preparación de las muestras para completar el secuenciamiento en un laboratorio tercerizado. Se continúa trabajando en forma conjunta con este Laboratorio para completar el análisis de metagenómica con amplicones 16S, incluyendo el análisis bioinformático. A fin de identificar aquellos microorganismos que descarboxilan histidina durante el proceso de elaboración de anchoíta salada y madurada, se realizaron los puntos 3 y 4: 3) Aislamiento de microorganismos formadores de histamina. Sobre todos los microorganismos mencionados, se realizó la prueba de formación de histamina a través de medios selectivos con histidina como única fuente de carbono (medio Niven). Más del 80% de los microorganismos aislados a partir de las muestras tomadas en empresa elaboradora de la ciudad de Mar del Plata dieron resultados positivos para la formación de histamina a partir de histidina, mientras que solo el 30% de las cepas aisladas a partir de la sal resultaron positivas. 4) Cuantificación de histamina por HPLC. Se realizó un entrenamiento en SENASA (Laboratorio Regional Mar del Plata) donde se estudió la técnica de cuantificación de histamina en músculo de pescado por HPLC. Asimismo se trabajó en el Laboratorio del GIPCAL con metodologia en cromatografia en capa delgada. Con el fin de manipular la cinética microbiana a fin de producir menor cantidad de histamina, se realizó la actividad 5: 5) Montaje del reactor. Se cultivaron en caldo Gibbons los microorganimos aislados en agar, instancia que presentó mucha dificultad. Como alternativa para el crecimiento de los microorganismos en caldo, se introdujo un soporte sólido para fijación bacteriana, sin obtener cambio en los resultados. Dado que la mayoría de los microorganismos presentes son aerobios estrictos, se está estudiando el crecimiento en caldo con agitación. Por otro lado, para la puesta en marcha del reactor es necesario seleccionar un caldo de cultivo traslúcido, que no presente turbidez y que sea satisfactorio para el crecimiento de los microorganismos seleccionados. Dado que el agar IRAM con leche fue el que dio mejores resultados, se están estudiando alternativas para modificar este medio, de manera tal que mantenga la misma performance en cuanto al crecimiento microbiano, pero que permanezca traslucido y sin turbidez. Tal es el caso de los medios en estudio: IRAM sin agregado de leche e IRAM con agregado de suero de leche.

Palabras clave
tecnología de los alimentos
microorganismos autóctonos
anchoita salada
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