Informe de becario

Informe científico de Beca de Estudio: Mazzer, Matías Ernesto (2015-2016)

Resumen

En el año de beca se han desarrollado distintos avances en el marco de la biocatálisis y los procesos sustentables, de acuerdo al plan de trabajo propuesto. Debido en parte a los altos costos de la obtención de compuestos antitumorales y a la generación de residuos implicada en los procesos químicos, se propuso desarrollar una alternativa que tuviera como prioridad el diseño de metodologías eco-eficientes y la alta selectividad de los productos finales. En la primer mitad del año, se llevó a cabo una búsqueda de lipasas de origen bacteriano a partir de un screening de más de 30 cepas provenientes del cepario interno del LIBioS. Se evaluó la capacidad hidrolítica de microorganismos de distintos géneros (Aeromonas, Bacillus, Enterobacter, Pseudomonas, Serratia, Staphylococcus) mediante un método colorimétrico basado en la hidrólisis de p-nitrofenil palmitato (sustrato específico de lipasas). Se seleccionaron los microorganismos que presentaron actividad lipásica en el sobrenadante de cultivo, se calcularon las unidades enzimáticas (UI/ml) y se realizaron cinéticas de crecimiento para determinar el tiempo óptimo de cultivo en el que se detectó mayor actividad. El screening concluyó con el hallazgo de 2 cepas con actividad lipasa (Aeromonas salmonicida spp. y Staphylococcus aureus). Los sobrenadantes de cultivo se concentraron mediante técnicas de precipitación, tales como precipitación con sulfato de amonio y acetona. Seleccionándose la primera debido a que fue la técnica más eficiente en términos de proteína total/actividad remanente. A fin de utilizar la proteína purificada en reacciones de acetilación de nucleósidos (cuya condición necesaria es actividad de agua igual a cero), esta fue sometida a liofilización hasta evaporación total del agua remanente. Los extractos crudos y parcialmente purificados fueron evaluados por electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante (SDS-PAGE) para verificar el peso molecular de las lipasas identificadas. Adicionalmente, los extractos precipitados se sometieron a un proceso de inmovilización por adsorción en un soporte octil-sepharosa, lo que permitió preservar la actividad enzimática durante tiempos prolongados. De esta manera, las proteínas cuya actividad en solución era de 2 semanas apróximadamente, conservaron la misma durante al menos 2 meses. Por otro lado, para determinar las condiciones óptimas de acetilación de Floxuridina se evaluaron distintos análogos de este nucleósido y agentes acilantes de diferente naturaleza. A su vez, se ensayaron distintas condiciones de reacción, como por ejemplo, distintos tipos de solventes, diferentes temperaturas y concentraciones de dador de acilo. El análogo utilizado en estas reacciones fue Timidina, la cual posee un grupo metilo en el carbono 5’ de la base. Además, al igual que la Floxuridina tiene 2 oxhidrilos libres (en las posiciones 3’ y 5’ de la ribosa) propensos a ser atacados por un nucleófilo. La eficiencia de la reacción depende en la mayoría de los casos de ciertos parámetros como la naturaleza del agente acilante (nucleófilo), la especificidad de la enzima, la solubilidad de los reactivos, entre otros. Cabe destacar que como modelo enzimático se utilizó la lipasa B de Candida antárctica (conocida comercialmente como Novozyme 435) cuya versatilidad fue provechosa para los objetivos planteados. Esta enzima demostró tener especificidad hacia el oxhidrilo 5’. Por lo tanto, con el uso de este biocatalizador se estableció un método rápido y eficiente para el seguimiento de la reacción por cromatografía en capa delgada (CCD) y se optimizaron las condiciones de corrida para la cuantificación por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). A su vez, se evaluaron distintas condiciones de reacción, como dadores de acilo de diferente longitud de cadena lipídica, agregado de co-solventes y concentraciones variables de catalizador y sustrato. Adicionalmente, mediante la utilización de un HPLC con colector de fracciones, y debido a los altos costos de la floxuridina, se llevó a cabo un protocolo de separación de la misma y posteriormente de concentración por Speed-Vac. A la finalización del año de beca, se llegó a obtener un fragmento por SDS-PAGE correspondiente a la banda enzimática de interés, con el objetivo de una futura secuenciación por MALDI-TOF. Por otra parte, se comenzaron a evaluar los procesos de inmovilización de microorganismos por atrapamiento (en alginato y/o acrilamida) para la obtención de Floxuridina de manera biocatalítica y su posterior modificación mediante las lipasas seleccionadas purificadas, como un proceso tipo batch.

Palabras clave
Biocatálisis
Floxuridina
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