Informe de becario

Informe científico de Beca de Estudio: Castaingts, Mélisse (2014)

Resumen

Durante el primer año de beca, me he dedicado a la generación de bibliotecas de pequeños RNAs (sRNAs) de raíces de P. vulgaris inoculadas con cepas de R. etli de alta y baja eficiencia en la nodulación. Para ello, se generaron tres réplicas biológicas de tejido de raíces de P. vulgaris de la variedad mesoamericana NAG12, que fue colectado 24 horas después de la inoculación con los rizobios. A partir de dicho tejido se aisló el RNA total y se purificó el RNA de bajo peso molecular mediante separación electroforesis en geles de acrilamida. A partir de esto RNA de bajo peso molecular se generaron bibliotecas utilizando el kit TruSeq Small RNA preparation kit, según recomendaciones del proveedor (Illumina). Se generaron bibliotecas a partir de las dos de las tres réplicas biológicas y de las tres condiciones ensayadas: raíces inoculadas con el medio de cultivo sin bacteria (condición control), inoculadas con SC15 (bacteria la más eficiente) y 55N1 (menos eficiente) obteniendose un total de seis bibliotecas. En cada biblioteca se utilizaron diferentes adapatdores indexados (bar coded) que permiten luego poolear las bibliotecas y realizar la secuenciación en una misma línea abaratando así el costo de secuenciación. La concentración e integridad de las bibliotecas fueron analizadas mediante electroforesis capilar utilizando un Agilent 2100 Bioanalyzer. Los resultados obtenidos indicaron que las bibliotecas contenian una alta concentración de cDNAs y buena calidad (presencia de un único pico) sin productos revelarse de degradación. Las bibliotecas se pooleraon y fueron enviadas a secuenciar al servicio HTS de University of California Riverside, USA. Dichas muestras han sido recibidas en el mencionado servicio y están a la espera para su pronta secuenciación en un secuenciador HiSeq2000. Para ello, se realizarán corridas que arrojan lecturas simples (single reads) de 50 pares bases. Por otra parte hemos iniciado un proyecto que apunta a analizar la función de varios microRNAs (miRNAs), para los cuales estudios de expresión previos indican que podrían cumplir algún rol importante durante la asociación simbiótica entre leguminosas y rizobios. Entre ellos se encuentran varias isoformas del miR169 y el miR390. Ensayos de RT-PCR cuantitativa (RT-qPCR) nos permitieron analizar la expresión de dicho precurosres en distintos órganos y tejidos de P. vulgaris, revelando que algunas de las isoformas de miR169 se expresan específicamente en nódulos formados por la cepa más eficiente. Para analizar la función de estos miRNAs se utilizará una estrategia que involucra la obtención de plantas que acumulan altos niveles (sobrexpresión) de dichos miRNAs y el análisis fenotípico asociado a la nodulación (ver plan de trabajo presentado originalmente). Utilizando cDNAs como molde, se amplificaron los precursores de miR169 y miR390, los cuales fueron clonados en el vector pENTRY/D/TOPO. Dichos clones fueron enviados a secuenciación y luego de confirmar su identidad, los mismos serán recombinados en el vector pK2GW7 y luego utilizados para la transformación de raíces de poroto mediada por Agrobacterium rhizogenes. En paralelo, se evaluó la expresión de distintos miembros de las tres subunidades (A, B y C) de factores de transcripción Nuclear Factor Y, los cuales son estudiados desde hace varios años en nuestro laboratorio. Se evaluó mediante RT-qPCR la expresión de 9 miembros de la familia NF-YA, 16 miembros de la familia NF-YB y 7 miembros de la familia NF-YC.

Palabras clave
ARN
Phaseolus
Rhizobium
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