Informe de investigador
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Informe científico de investigador: Aphalo, Paula (2013)

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Resumen

Como punto de partida, se preparon aislados de amaranto por extracción acuosa en medio alcalino (pH 9) y posterior precipitación isoeléctrica (pH 5), según el procedimiento utilizado comúnmente en nuestro laboratorio (Martínez y Añón, 1996). Se determinó la solubilidad de los aislados, en dos buffers: a) con elevada fuerza iónica (K2HPO4 32,5 mM, KH2PO4 2,6 mM con NaCl 0,4M pH 7,5) y b) de baja fuerza iónica (K2HPO4 33,3 mM, KH2PO4 1,7 mM pH 8,5), en ambos la solubilidad fue cercana al 80%. Los aislados fueron posteriormente hidrolizados en diferente extensión haciendo uso de la enzima alcalasa (8 μl enzima/100 mg proteína) a 37º C durante 1, 2, 4, 6, 22 y 26 horas. La reacción enzimática se detuvo por calentamiento a 80ºC durante 10 minutos. Las muestras fueron congeladas, liofilizadas y almacenadas en desecador hasta su uso. El grado de hidrólisis de las muestras fue determinado mediante el ensayo de OPA (Nielsen y col 2001), obteniéndose los siguientes resultados: 1h 8,70 ± 0,78 %, 2h 8,82 ± 0,81 %, 4h 16,48 ± 1,76 %, 6h 19,84 ± 0,72 %, 22h 30,2 ± 3,01 % y 26h 35,2 ± 2,20 %.Los hidrolizados obtenidos fueron caracterizados mediante SDS- PAGE tricina; los perfiles electroforéticos obtenidos permitieron concluir que la hidrólisis de las moléculas de mayor tamaño presentes en el aislado entero son completamente hidrolizadas en el transcurso de la primera hora de reacción. Los polipéptidos de mayor resistencia a la hidrólisis fueron las subunidades básicas (20 kDa) las cuales fueron detectadas hasta las 6 horas de hidrólisis; a tiempos más largos, 21 y 26 horas, los mismos no pudieron ser detectados mediante el ensayo de electroforesis. Los hidrolizados también fueron analizados mediante Cromatografía de exclusión molecular (AKTA-purifier). Para ello, se utilizó una columna con un rango de separación de masas moleculares entre 100-7000 Da, y una longitud de onda para la detección de 214 nm. Los resultados obtenidos nos permitieron concluir que a partir de las 21 horas de hidrólisis se encuentran presentes en los hidrolizados mayoritariamente moléculas con una masa molecular no mayor a los 2000 Da; a tiempos menores se detectan especies con una masa molecular mayor a los 7000 Da que eluirían a volúmenes coincidentes con el volumen muerto de la columna. Continuando con las actividades planteadas, todos los hidrolizados obtenidos con alcalasa fueron sometidos a una digestión gastrointestinal simulada (item 2 plan de trabajo presentado). Brevemente, la digestión se inició con la adición de un fluido símil saliva (conteniendo diferentes sales y 290 mg/l α-amilasa a pH 6,8) a las muestras en estudio (aislado no tratado e hidrolizados con alcalasa), al cabo de 5 min se les adiciónó un símil fluido gástrico (conteniendo NaCl 0,03 M y 2,5 gr/l pepsina pH 2,0). Luego de 1 h se agregó un símil de fluido duodenal conteniendo bicarbonato de sodio 0,1 M y pancreatina, de manera de alcanzar un pH 7 - 7,5; manteniéndose la incubación por 1 h adicional. Las muestras se mantuvieron con agitación por inversión a 37 ºC durante todo el proceso. Una vez finalizada la simulación de la digestión gastrointestinal, se detuvo la reacción enzimática por calentamiento a 80 ºC durante 10 minutos. Las muestras digeridas obtenidas, fueron congeladas, liofilizadas y almacenadas en desecador hasta su uso. El grado de hidrólisis de las muestras hidrolizadas y digeridas fue determinado mediante el ensayo de OPA; los resultados obtenidos fueron los siguientes: aislado digerido: 25 %, 1 h: 25,4 %- 2 h: 27,3 %- 4 h: 27, %- 6 h: 29,6 %- y 22 h: 35,8 %. Estas muestras fueron analizadas mediante cromatografía de exclusión molecular: en todos los casos se observó un aumento significativo de las poblaciones peptídicas con un tamaño molecular que no superarían a los 6 aminoácidos. A efectos de determinar la potencial actividad antihipertensiva de los péptidos obtenidos y caracterizados y vistos los problemas de importanción existentes se se tuvo que extraer enzima conversora de angiotensina (ECA) a partir de pulmones de conejo. (item 3 del plan de actividades anteriormente presentado).Se realizaron extracciones con diferentes buffers (fosfato y borato de sodio) a idéntica concentración y pH 8,3. La medida de actividad enzimática de los extractos crudos obtenidos se realizó de acuerdo a la técnica descrita por Hurst y Lowell 1981. Los resultados obtenidos, evidenciaron que la ECA fue activa cuando se utiliza buffer borato como solvente de extracción. Se realizaron corridas electroforéticas en condiciones desnaturalizantes de los extractos crudos obtenidos a partir de los pulmones de conejo y de una ECA comercial (marca Sigma-Aldrich) y se compararon los perfiles obtenidos. Los mismos fueron coincidentes, observándose una banda de mayor intensidad con una masa molecular de 140 kDa, masa molecular de la ECA según datos registrados en bases de datos para proteínas secuenciadas. Se encuentran en curso los ensayos tendientes a determinar la actividad antihipertensiva potencial de los hidrolizados con alcalasa y aquellos posteriormente sometidos a la digestión gastrointestinal simulada.

Palabras clave
amaranto
actividad antihipertensiva
péptidos
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