Informe de becario

Informe científico de Beca de Estudio: Oyarburo, Natalia Soledad (2013)

Resumen

El objetivo general del estudio realizado en el transcurso de la presente beca fue evaluar la participación de compuestos relacionados con la vía del ácido salicílico (SA) en la respuesta de defensa inducida en papa por fosfitos (Phi) frente a estreses bióticos y abióticos, en particular, la infección por Streptomyces scabies y la radiación ultravioleta (UV-B), respectivamente. Durante este primer año, el estudio bioquímico- molecular se realizó en el sistema de estrés abiótico (UV-B), y se realizaron estudios fitopatologicos del efecto del Phi en el patosistema papa-Streptomyces scabies. Se determinó la expresión de genes marcadores de la vía del acido salícilico, y la activdad y contenido de enzimas relacionadas con dicha vía, en plantas tratadas y no con Phi y expuestas o no a UV-B. Para llevar a cabo los objetivos, trabajamos con plantas de papa de variedad industrial, las cuales se trataron por spray foliar con una solución 1% fosfito de potasio (KPhi) al inicio de la tuberización. Tres días después, se sometieron a radiación UVB por 2hs diarias durante 0, 3, 5 y 6 días. Como control se utilizaron plantas que fueron sometidas solo a radiación UV-B, tratadas con KPhi solamente y que no recibieron tratamiento. En cuanto al análisis fenotípico (objetivo 1), se midió de forma preliminar el índice de verdor de hojas de plantas sometidas a los distintos tratamientos utilizando la herramienta SPAD (medidor del contenido de clorofila). El índice de verdor es una medida de la capacidad fotosintética de la hoja. A partir de dicha medición, se observó a 9 y 40 días post exposición a la radiación UV-B que el tratamiento con KPhi evita la disminución del índice de verdor causada por la radiación UV-B. Actualmente estamos creciendo plantas para analizar otros parámetros fenotípicos como marchitamiento, tiempo a la senescencia, producción de tubérculos entre otros, y repetir la medición del índice de verdor. A su vez, se realizó la cuantificación de enzimas relacionadas con el estrés oxidativo mediante tinciones diferenciales en geles de poliacrilamida (objetivo 3 del plan de trabajo). Para ello, se realizaron extractos de proteínas solubles de hojas de plantas de papa, los cuales se separaron en geles de poliacrilamida y se tiñieron diferencialmente para determinar la actividad de Superóxido dismutasa (SOD), Guaiacol-peroxidasas (POD) y Ascorbato peroxidasas (APX). Observamos una expresión diferencial de SOD y POD, las cuales aumentaron en plantas pretratadas con KPhi y luego expuestas a UV-B, respecto al control o solo tratado con UV-B. Además, se observó un aumento de expresión de las mismas con el aumento de los días de exposición a la radiación UV-B. De forma preliminar, se realizó un Isoelectroenfoque en un amplio rango de pH para separar e identificar las isoformas de POD que se inducen diferencialmente. En el mismo, observamos la inducción de isoformas POD ácidas, obteniendo un resultado que concuerda con el observado en el gel de actividad de poliacrilamida. El isoelectroenfoque se repetirá acotando los pHs de la corrida hacia los pHs ácidos para lograr una separación mas precisa y una posterior identificación de las mismas. La actividad de APX se determinó en geles de poliacrilamida pero las 2 tinciones que realizamos no arrojaron un resultado positivo. Es decir, el gel se tiño del color correspondiente pero no se observó ninguna banda de actividad. También se intentó determinar la actividad de dicha enzima a partir de extractos crudos mediante una técnica espectrofotométrica pero los resultados tampoco fueron claros. En estos momentos estamos probando un protocolo de extracción específico para esta enzima los cuales repetiremos la cuantificación de actividad ya sea en geles de actividad o en tubo. Se cuantificó también el contenido de enzimas relacionadas con la patogénesis (PRPs), en particular β-1,3-glucanasas y quitinasas, mediante Western-blot. Se observó al igual que con las enzimas antioxidantes, un aumento en el contenido de ambas enzimas en plantas pretratadas con KPhi y expuestas a UV-B con respecto a los controles. Posteriormente, se determinó a nivel transcripcional la expresión del gen PR1, un marcador de la vía del ácido salicílico, mediante Real Time-PCR (objetivo 2). Para ello se realizó la extracción de RNA a partir de hojas de los distintos tratamientos con los cuales se realizó la síntesis de cDNA. Estos últimos se utilizaron como templados para las reacciones de Real Time-PCR utilizando primers específicos para dicho gen. Los resultados se encuentran aun en etapa de análisis, pero los mismos sugieren una inducción de PR1 inducida por KPhi. Las figuras correspondientes a los resultados aquí expuestos pueden verse en el anexo de “Manuscrito en preparación” Con respecto a los objetivos relacionados con el estrés biótico, se trabajó en la puesta a punto del sistema experimental. Trabajamos en primer lugar poniendo a punto la infección de rodajas de tubérculos de papa con diversas cepas de Streptomyces scabies las cuales poseen distinto grado de virulencia, y fijamos la cantidad óptima de inoculo con la cual infectar para obtener un resultado claro y preciso. Decidimos continuar trabajando con la cepa 9, la cual fue altamente virulenta y la infección era clara y bien diferenciable. Una vez determinada la cepa con la cual realizar las infecciones y la cantidad de inóculo a utilizar, realizamos infecciones de rodajas de tubérculos pretratadas por spray con una solución 1% KPhi. Se utilizaron rodajas de tubérculos rociadas con agua como control. Observamos una disminución del porcentaje de la infección en tubérculos pretratados con KPhi con respecto a los tubérculos control.

Palabras clave
Streptomyces
Ácido Salicílico
Rayos Ultravioleta
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